Penetapan Kadar Vitamin B1 (thiamin)

Kandungan tiarnin pangan dapat ditentukan dengan gabungan kromatografi, fluorimetri. Prinsip analisis kandungan tiamin, yaitu ekstrak tiamin bahan pangan dengan asam encer panas dan dicerna dengan fosfatase pada pH 4,5, lalu ekstraks dielusi melalui silikat penukar basa. Tiamin yang terelusi, dioksidasi dengan ferisianida basa menjadi tiokirom, lalu diukur secara fluorimetri.

Prosedur analisis tiamin rneliputi:

·         ekstraksi,

·         pemurnian,

·         oksidasi,

·         pengukuran fluorosensi.

Prosedur ekstraksi tiamin, yaitu

1. masukkan sampel dengan berat di bawah 5 gram ke dalam tabung reaksi 100 ml yang dilengkapi gelas pengaduk,
2. tambahkan 50 ml HCl 0,2 N, lalu panaskan tabung selama 30 menit dalam penangas air sambil diaduk,
3. pada akhir cerna, sampel harus masih asam (uji dengan indikator bromokresol hi jau),
4. dinginkan ekstrak sampaj suhu di bawah 50 °C,
5. pH diatur sekitar 4 - 4,5, dengan sodium asetat sekitar 5 ml,
6. tambahkan 5 ml suspensi enzim segar dan aduk, lain inkubasi pada suhu 37 °C semalam, kemudian dinginkan sampai suhu kamar,
7. tuang ekstrak ke dalam labu takar 100 ml, dan encerkan sampai tera dengan air suling,
8. saring ekstrak dengan kertas saring berporositas cepat, encerkan ekstrak hingga mengandung tiamin kurang dari 0,05 mg/ml.

Prosedur pemurnian tiamin, yaitu

1. isi kolorn kromatogafi dengan 6 gram silikat penukar basa yang disuspensikan dalam aquades
2. biarkan mengalir hingga sisa 2 mm di atas permukaan silikat,
3. tambah 5 ml asam asetat 3% ke dalam kolom, biarkan mengalir ke bawah,
4. masukkan 25 ml ekstrak sampel ke dalam kolom biarkan mengalir ke bawah,
5. buang eluat yang diperoleh,
6. cuci kolom sebanyak 3 kali masimg-masing dengan 10 ml air mendidih, lalu eluat dibuang,
7. elusi tiamin dari kolom sebanyak 2 kali masing-masing dengan 10 ml potasium klorida panas (hampir medidih),
8. kumpulkan eluat, lalu masukkan ke dalam labu takar 25 ml,
9. dinginka sampai suhu kamar, dan encerkan sampai tera dengan larutan asam KCL dan kocok hingga rata.

Prosedur oksidasi dalam analisis kandungan tiamin, yaitu

1. masukkan sebanyak 10 ml sampel ke dalam labu pernisah yang berbeda,
2. ke dalam labu pemisah I, tambahkan 5 ml potasium ferisianida basa (larutan uji), dan ke dalam labu pemisah ke-2 tambahkan 5 ml NaOH 15 % (blanko),
3. masukkan 5 ml etanol ke dalam keduanya,
4. tambahkan masing-masing 25 ml isobutanol, kocok hingga rata, dan masukkan nitrogen ke dalam larutan hingga tercampur rata,
5. buang lapisan aquaeus yang berada dibawah sampai tinggal 1 ml dengan menggunakan tabung blow-out
6. tambahkan etanol ke dalam lapisan isobutanol, kocok hati-hati dan jaga agar lapisan aquaeus tidak terganggu,
7. masukkan masing-masing 10 ml alikuot larutan kerja tiamin baku, dan masukkan masing-masing ke dalam labu pemisah 100 rnl yang berbeda, dan ulangi langkah 2-7.

Prosedur pengukuran fluorensensi, yaitu

1. sesuaikan panjang gelombang eksitasi pada 360 nm, dan panjang gelombang emisi pada 435 nm,
2. isi sel fluorometer dengan asam sulfat 0,1 N dan sebuah sel lainnya dengan larutan alikuot, lapisan isobutanol yang diperoleh dari tahap 8 oksidasi tiamin,
3. atur fluorometer sampai memberi tanda angka nol untuk asam sulfat 0,1 N dan angka 100 untuk larutan baku,
4. ukur semua larutan sampel dan blanko.

Kandungan tiamin ditentukan berdasarkan perhitungan dengan rumus

W          : berat sampel (g),

Ss          : pembacaan standar

Sb         : pembacaan blanko standar,

Ts          : pembacaan sampel,

Tb         : pembacaan blanko sampel

Ts - Tb : fluorcsensi tiokrom sampel

Ss - Sb : fiuorcsensi tiokrorn standar

Volume ekstrak : 100

Alikuot hasil oksidasi : 10 

Sumber :

• Tejasari "Nilai -Gizi Pangan" 2005,  Graha Ilmu.

Artikel Terkait :